AOA电竞官网:《食品科学》：扬州大学杨振泉教授等：樟芝深层发酵多

　　人类的肠道菌群是一个由数万亿细菌组成的微生物生态系统。目前，抗生素参与疾病治疗的现象越来越普遍，在长期使用抗生素的过程中，有益菌大量流失，同时耐药的有害微生物数量不断增加，导致有害菌逐渐占据主导地位，最终导致患抗生素相关性腹泻及其他慢性疾病的风险急剧增加。

　　樟芝（Antrodia cinnamomea）又名牛樟芝、牛樟菇等，是一种珍稀的药食两用蕈菌，具有解酒保肝、抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、降血脂及调剂免疫等多种生物活性。近年来，研究者从樟芝子实体和发酵菌丝体中分离出200余种活性物质，其中，多糖是最主要的活性物质之一，具有较高的研发价值。

　　扬州大学食品科学与工程学院的李华祥，吉丹，杨振泉*等首先提取和纯化樟芝深层发酵所产胞内多糖（AIPS）及胞外多糖（AEPS），再对其进行组成分析及结构表征，最后探究其对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的调节作用。

　　用Sevag法经8 次脱蛋白处理后，检测樟芝多糖组成情况。由表1可知，AEPS和AIPS的总中性糖质量分数分别为82%和88%，蛋白质量分数均小于1.5%，纯度已足以用于小鼠实验。此外，AEPS和AIPS的主要组成单糖均为葡萄糖、半乳糖及甘露糖，但含量差异较大。其中，在葡萄糖相对含量方面，AEPS为84.73%，而AIPS为55.31%；在半乳糖相对含量方面，AEPS为7.84%，AIPS却高达28.52%；在甘露糖相对含量方面，AEPS为5.27%，AIPS高达14.34%。此外，AEPS中还含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，相对含量分别为0.76%和1.4%，而AIPS中则含有1.83%的氨基半乳糖。

　　樟芝多糖的分子质量分布结果如图1所示，AEPS主要由3 种不同分子质量的多糖组成，其中分子质量为1 013 kDa的多糖占比为77.96%，分子质量为233 kDa的多糖占比为18.04%，分子质量为28 743 kDa的多糖占比为3.99%。AEPS的平均分子质量为4.16×10 5 Da；AIPS主要由2 种不同分子质量的多糖组成，其中分子质量为12 452 kDa的多糖占比为49.54%，分子质量为1 623 kDa的多糖占比为50.46%。AIPS的平均分子质量为3.52×10 6 Da。可见，AEPS和AIPS在多糖组成上亦有着明显差异。

　　樟芝多糖红外光谱分析结果如图2 所示，在4 000～400 cm -1 范围内，AEPS在3 400 cm -1 左右有强而宽的吸收峰，这主要是由多糖中羟基的伸缩振动引起的；在1 673 cm -1 左右有强而宽的吸收峰，这主要是由羰基（C＝O）的伸缩引起的，表明AEPS具有酰胺结构；在1 100 cm -1 处有强而宽的吸收峰，这主要是由吡喃环结构的C—O键引起的，说明AEPS具有吡喃糖环；在944 cm -1 处有强而宽的吸收峰，说明AEPS存在β-型糖苷键（图2A）。AIPS在3 276 cm -1 左右有强而宽的吸收峰，这主要是由多糖羟基中分子间的氢键伸缩振动引起的；在3 000 cm -1 左右有吸收峰，这主要是由—CH—键引起的，表明AIPS具有—C≡C—H结构；在1 642 cm -1 左右存在强吸收峰，表明AIPS存在酰胺结构；在1 074 cm -1 和1 047 cm -1 处存在强吸收峰，表明AIPS存在C—O结构（图2B）。

　　建立体外消化模型，对樟芝多糖的抗消化能力进行测定，结果如图3所示。AEPS在α-淀粉酶的作用下，水解度随着时间的延长而增加，在150 min后水解度变化不明显，约为0.02%（图3A）。AEPS在不同pH值的胃模拟液中水解度也较低，在不同pH值条件下的水解度都会随着时间的延长而增加（图3B），其中在pH 2.0条件下水解度最高，210 min时约为0.05%，AEPS在pH 3.0胃模拟液中的水解度高于pH 4.0胃模拟液中的水解度。此外，AIPS在α-淀粉酶的作用下，180 min时的水解度为0.028%（图3C）。AIPS在不同pH值的胃模拟液中水解度较AEPS高，AIPS同样也在pH 2.0的胃模拟液中水解度最高，210 min时为0.064%（图3D）。上述结果表明，AEPS及AIPS均具有较强的抗消化能力，即若口服樟芝多糖，其可顺利进入肠道并发挥作用。

　　如图4所示，不同LIH剂量组小鼠停药后4 d内的状态和表现差异较为明显。灌胃2.7 g/kg mb LIH的小鼠毛发状态与正常对照组相比没有明显的变化，均较为平滑；此外，小鼠活动正常，摄食量与正常对照组相比无明显差异。灌胃3.7 g/kg mb LIH的小鼠出现轻微的脱毛现象，并且活动迟缓、毛发粗糙、食欲减退，摄食量与正常对照组相比明显减少；灌胃4.2 g/kg mb LIH的小鼠出现多处大面积的脱毛现象，行为活动迟缓、烦躁少动、食欲不振，几乎不摄食。此外，从小鼠粪便形态来看，灌胃2.7 g/kg mb LIH的小鼠出现轻微腹泻，并在停药1 d后即完全恢复正常；灌胃3.7 g/kg mb LIH的小鼠粪便稀软、不成形，呈烂泥状，表现为中度腹泻，并在停药4 d后恢复正常；灌胃4.2 g/kg mb LIH的小鼠粪便稀溏，稀薄如水，呈现水样便，表现为严重腹泻，并在停药4 d后仍持续腹泻。综上所述，最终选择3.7 g/kg mb作为后续小鼠建模的LIH给药剂量。

　　为了解各组小鼠体内肠道菌群的物种丰富度和均一性，首先对小鼠肠道菌群测序结果进行α-多样性分析，结果如图5所示。RG组小鼠肠道菌群的多样性明显低于NC组，说明LIH严重破坏了小鼠体内的肠道菌群平衡，并抑制或杀死了大量微生物；同时，灌胃AEPS、AIPS及FOS（低聚果糖）均有助于调节和恢复小鼠肠道菌群的多样性，且AEPS的效果优于AIPS和FOS。

　　为了比较不同处理组间小鼠肠道菌群结构的差异，对测序结果进行了β-多样性分析（主坐标分析（PCoA）和非度量尺度（NMDS）分析）（图6）。结果表明，不同处理组之间的小鼠肠道菌群结构均具有明显差异，说明灌胃LIH、AEPS、AIPS及FOS均对小鼠肠道菌群结构产生了较为明显的影响，也说明樟芝多糖对小鼠肠道菌群多样性具有明显的调节作用。此外，从各组中重复样本间的距离来看，各组重复样本均较为集中，说明各重复样本的差异较小，重复性较好。

　　绘制各组小鼠肠道菌群在门水平、科水平及属水平上丰度排名前10的微生物相对丰度柱形图。结果表明，从门水平来看，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和变形菌门（Proteobacteria）为主要的优势菌群，所占的比例约为总菌群的95%（图7A）。此外，在变形菌门的占比上，NC组明显低于RG、AEPS、AIPS及FOS组，但在拟杆菌门的占比上，NC组明显高于RG、AEPS、AIPS及FOS组；厚壁菌门在各处理组小鼠肠道中的相对丰度较低，但与NC组相比，AEPS组中厚壁菌门的相对丰度大幅增加（图8A）。

　　从科水平来看，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）及疣微菌科（Ruminococcaceae）为主要的优势菌群，所占的比例约为总菌群的80%（图7B）。乳酸杆菌是益生菌群，AEPS组中乳酸杆菌科的相对丰度明显高于NC、RG及AIPS组（图8B），表明灌胃AEPS可以大幅提升小鼠肠道内乳酸杆菌科的相对丰度；肠杆菌科在RG及AIPS组中的相对丰度明显高于NC、AEPS及FOS组。从图8B中可看出，灌胃AIPS后，小鼠肠道内Staphylococcaceae的相对丰度较NC及RG组急剧上升，这一现象在AEPS及FOS组中均未出现，而Staphylococcaceae为有害菌。此外，AIPS组中Ruminococcaceae的相对丰度较其他组明显增加，而Ruminococcaceae亦为有害菌。

　　为了进一步分析不同组间小鼠肠道菌群相对丰度差异较大的微生物物种，选取微生物相对丰度排名前35 的属，根据其在每个组中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图。如图9 所。